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腹腔巨噬細胞和骨髓巨噬細胞的分離提取和誘導極化

更新時間:2023-04-20   點擊次數:90次

巨噬細胞是機體免疫系統的重要細胞成分,具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應答、免疫調節等生物學功能,是研究細胞吞噬、細胞免疫和炎癥的重要對象。

巨噬細胞的極化

  巨噬細胞具有異質性和多樣性,可在不同的組織微環境和生理病理條件下,轉化為不同的表型,稱為巨噬細胞的極化。

  巨噬細胞組織分布多樣性和異質性的特點,使之一直以來都是科研工作者們熱門研究的對象。

  根據細胞表面標記分子、細胞因子分泌及代謝相關基因特征,巨噬細胞通常被分為經典活化的M1型巨噬細胞(促炎)和選擇性活化的M2型巨噬細胞(抗炎)。

  ■ M1型巨噬細胞表達MHC II、CD80、CD86和 CD16/32,分泌TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子,以及CXCL9、CXCL10和CXCL11等趨化因子。

  ■ 另外,M2型巨噬細胞高表達arginase-1(Arg1)和CD206,分泌抗炎因子IL-10以及CCL2、CCL17和CCL22等趨化因子。

  巨噬細胞極化的體外研究,通常使用脂多糖(LPS)和干擾素(IFN-γ)等TLR激動劑誘導M1型極化,使用IL-4或IL-13等誘導M2型極化,然后記錄基因表達、細胞表面標志物及蛋白質含量和活性的變化。

  原代小鼠巨噬細胞可以從多個部位獲得:比如骨髓、腹腔、肺或脂肪組織等。目前巨噬細胞的分離的方法主要包括貼壁篩選法、密度梯度離心法、酶消化法、流式細胞儀分離法等。

  下面具體介紹小鼠腹腔巨噬細胞和骨髓來源巨噬細胞的提取和分離。

腹腔巨噬細胞提取

  巨噬細胞天然存在于小鼠腹腔,腹腔巨噬細胞多游離存在于腹水中易于獲得:用生理鹽水或細胞培養基沖洗腹腔后抽取腹腔灌洗液體,即可獲取其中的巨噬細胞。

  以下為具體實驗方案:

(1)巨噬細胞的誘導

  在實驗前3天,連續3天給小鼠腹腔注射1mL的3%巰基乙酸鹽肉湯,每天1次。(肉湯刺激是非感染性炎癥刺激,能促進巨噬細胞的聚集)

  注:

  ■ 腹腔注射是關鍵,給肉湯時記得回抽,切記不能刺到器官導致小鼠腹腔出血,否則會使提取的巨噬細胞不純。

  ■ 硫乙醇酸鹽的作用是將巨噬細胞由外周血中釋放入腹腔中,可提取更多的巨噬細胞用于實驗,腹腔巨噬細胞多為M1促炎型。

(2)3天后,收集巨噬細胞

  ① 處死小鼠

  準備75%乙醇,小鼠麻醉后,以脫頸方式處死小鼠,將小鼠置于75%乙醇中浸泡3-5min進行滅菌消毒處理后(注:使小鼠的腹腔朝下浸沒在酒精中),移入超凈臺,仰臥位固定小鼠。

  ② 暴露腹膜

  將小鼠外皮拉起,沿腹部剪開一個小口(注意勿將腹膜剪破),再剪開整個腹部皮膚,捏住兩側皮膚慢慢向兩邊撕開,使腹膜暴露。

  ③ 向腹腔注射生理鹽水或細胞培養基:

  于右下腹部將5mL預冷的PBS(或5mL預冷的10%血清RPMI-1640培養液)緩緩注入腹腔(注意不要抽進空氣),輕揉小鼠腹部數次,靜置3-5min,使液體在腹腔內充分流動。

  注:

  ■ 腹腔注射直接會接觸表皮,易污染,此步驟需要多加注意。

  ■ 腹腔注射培養基后,按壓動作要輕柔緩慢,以防培養基從針孔溢出。

  ④ 抽取腹腔液,轉移至離心管中(反復沖洗腹膜腔灌洗液2次)。



(3)巨噬細胞的純化與培養

  將收集的腹腔灌洗液于常溫條件下1000r /min 離心5min,棄去上清,所得細胞沉淀用RPMI-1640培養液重懸接種,培養體系于37℃靜置培養2~3h后,洗去未貼壁細胞,余下的貼壁細胞即為巨噬細胞。

  注:由于腹腔巨噬細胞的粘附能力不強,清洗的時候動作要盡可能輕。

注意事項

  ■ 小鼠腹腔注射刺激物時不要刺破內臟,可以在操作過程中將小鼠頭部向下抓取,使其腹部內容物滑向膈下以避開注射器針頭;

  ■ 若回收的小鼠腹腔灌洗液過少,可另外注入預冷的PBS重復灌洗;

  ■ 若不小心致腹腔出血,可在腹腔液離心后重懸時加入5倍細胞懸液體積的紅細胞裂解液,再次離心棄上層紅色液體。

  ■ 盡量避免被小鼠咬傷或吸過小鼠腹腔液的針頭扎傷,一旦被咬傷或扎傷,要到專門機構盡快注射出血熱疫苗,如果創面大,需同時注射破傷風疫苗。



骨髓來源巨噬細胞的提取

  在原代巨噬細胞的獲取中,直接分離的腹腔巨噬細胞(或者肺泡巨噬細胞)數量有限,在未經誘導時,每只小鼠只能獲取1.5-3×106個腹腔巨噬細胞,不能滿足某些實驗的需求,因此骨髓誘導分化的巨噬細胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDM)是目前實驗室常用的分離小鼠巨噬細胞的選擇。

  以下為具體實驗方案:

(1)誘導因子的獲取

  M-CSF是一種誘導骨髓細胞向M2型巨噬細胞分化的誘導因子,獲取的途徑有兩種:

  1)找商業化的細胞因子產品直接購買,但不同廠家的細胞因子活性差異較大,需仔細甄別。M-CSF的使用濃度在20-50ng/mL即可。

  2)自己培養能夠分泌這種細胞因子的細胞,其中L929細胞上清含有較高活性M-GSF以及其它多種細胞因子,比如VEGF、MCP-1、MIG、IL-9/10等。該培養體系可以在短時間內獲得大量巨噬細胞樣的細胞,并且該體系不適合其它細胞生長,因而其它各系細胞會逐步死亡,經換液去除懸浮細胞后,最終可以獲得大量純化的骨髓巨噬細胞樣細胞。



(2)骨髓巨噬細胞的分離

  1)取腿骨

  準備75%乙醇,小鼠麻醉后,脊髓脫臼法處死小鼠,將小鼠置于75%乙醇中浸泡5min進行滅菌消毒處理;

  轉移到超凈工作臺,固定小鼠上肢,用剪刀從腹部中線剪開,取其雙側股骨和脛骨,剔除骨上附著的肌肉和組織(注意:應盡量將肌肉組織去除,只留下骨頭,整個過程務必保持股骨及脛骨的完整性!)

  將去皮去肉的股骨、脛骨放置在含有75%乙醇的培養皿內浸泡5min(注:75%乙醇對骨髓細胞沒有影響,但盡量要控制在5 min之內),然后用冷的PBS浸泡,洗去脛骨、股骨表面的乙醇,5min。

  2)骨髓巨噬細胞提取和誘導

  將清洗好的股骨、脛骨分開,并用剪刀分別將股骨、脛骨兩端剪斷,使用1-2mL注射器吸取冷的誘導培養基將骨髓從股骨、脛骨中吹出,反復吹洗3次,直至骨內看不到明顯的紅色為止。

  此時可能會有紅色條狀物質,這是聚集的骨髓細胞,用5mL移液槍將含有骨髓細胞的培養基反復吹打,將塊狀的細胞團吹散。

  然后使用70μm細胞濾器將細胞過篩,轉移至15mL離心管中,1500rpm/min離心5min,棄上清。

  加入紅細胞裂解液重懸,輕彈管底,混懸細胞沉淀,靜置5min后,加入10 mL 冰PBS進行洗滌,4°C,1500rpm/min離心5min,棄上清(必要時重復,直至細胞團塊紅色部分明顯減少),用冷的配置好的骨髓巨噬細胞誘導培養基重懸,鋪板。

  細胞培養期間,每隔2-3天更換新鮮骨髓來源巨噬細胞培養基,加入培養基前用PBS清洗細胞,培養7天后收集細胞。



注意事項:

  ■ 骨髓巨噬細胞不可傳代,不可以用胰酶消化,使用時可用細胞刮直接刮下來或者用槍吹打下來,然后離心計數即可用于實驗。

  ■ 建議直接鋪板用于后續實驗,更換培養容器會損傷細胞。

  ■ 細胞誘導成功后要及時使用,不宜長時間培養。

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